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本发明公开了一种面向三维生物样本成像的自动追焦方法及系统，属于显微成像技术领域。所述方法包括获取三维生物样本对应的原始光场显微图像数据；基于所述原始光场显微图像数据构建深度图；根据所述深度图提取所述三维生物样本中目标区域的位置参数；并根据所述位置参数确定所述三维生物样本的位置状态；根据所述位置状态通过闭环反馈控制调节焦平面。本申请响应速度快，追焦精度高，可满足长期活体成像需求；相比现有技术，本发明不需要额外的硬件装置，集成度高，成本低，具有显著的创新性和实用价值。