常州制药厂有限公司

本发明涉及提高转氨酶催化活性和底物特异性的改造方法、突变体及其应用，属于酶工程技术领域。本发明从氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的亲本转氨酶CA032出发，建立了一套机器学习结合理性设计的蛋白质工程化改造模式：通过同源比对构建初步突变库；耦合机器学习（ML）适应度预测模型与物理稳定性过滤进行高通量虚拟筛选；结合多尺度分子动力学（MD）模拟优化。筛选获得的突变体CA032 M4在100 g/L的高底物负荷下实现了大于99.9%转化，对映选择性>99% ee，为尼拉帕利手性合成提供了高效的生物催化方案。

本发明公开了一种机器学习指导的ω‑转氨酶定向进化方法及其在瑞美吉泮关键手性胺中间体合成中的应用。以野生型转氨酶CA113为起始酶，通过多序列比对（MSA）生成共识序列，结合5‑ns丙氨酸扫描分子动力学（MD）模拟和CAVER通道分析，筛选出18个单点突变构建微型文库（库容量48）。将突变体的稳态动力学参数（kcat/Km）与热熔温度（Tm）上传至基于预训练算法的小样本迁移学习回归模型进行训练。通过两轮“湿实验‑模型训练‑虚拟筛选”迭代循环，获得最优双突变体M5（R68F/D125V）。该突变体在1 L反应器、底物终浓度25 mg·mL⁻¹、酶载量1 g·L⁻¹、25℃、pH 9.0条件下，时空产率达到92 g·L⁻¹·d⁻¹，分离收率81%，ee>99%，连续3批百克级制备的RSD<3%，满足API杂质谱要求。本发明为绿色、高效、低成本的制药酶工程提供了可复制的新范式。