中国农业科学院兰州兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心兰州分中心）

本发明提供了一种微小隐孢子虫卵囊蛋白的单克隆抗体及其制备方法和应用，属于抗体技术领域。本发明利用流式分选单个抗原特异性B淋巴细胞，以EL4B5作为饲养层细胞在特定的培养基中进行刺激分化培养，得到的浆细胞裂解进行PCR扩增，得到单克隆抗体的可变区序列，再通过重组表达得到微小隐孢子虫卵囊蛋白单克隆抗体。本发明提供的微小隐孢子虫卵囊蛋白的单克隆抗体，包括微小隐孢子虫单克隆抗体2B2、2E10和3H8中至少一种。本发明对通过重组表达得到的单克隆抗体进行抗原亲和力验证，结果表明，3种单克隆抗体均具有良好的抗原亲和性，同时还具有良好的检测特异性，为后续微小隐孢子虫及其感染疾病的诊断和检测提供了有效工具。

本发明公开了一株A型口蹄疫病毒146S抗原特异性单域抗体及其应用。本发明以灭活的A型FMDV A/WH/09毒株146S抗原免疫骆驼，结合抗原特异性细胞分选、高通量测序和ELISA筛选，获得一株单域抗体VHH‑A25，所述单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，或与SEQ ID NO:4具有至少95%同源性且具有相同抗原结合特异性的氨基酸序列。ELISA鉴定结果表明，VHH‑A25对A/WH/09毒株146S抗原具有明显反应，而对A/WH/09毒株12S降解产物及O型FMDV抗原反应较弱，提示其能够优先识别A/WH/09毒株完整146S颗粒。该单域抗体可用于A型FMDV A/WH/09毒株146S抗原检测、疫苗抗原质量评价及相关检测试剂盒制备，具有特异性好、易于重组表达和应用开发等优点。

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及NCAM2过表达细胞系的构建及作为塞内卡病毒生产细胞系的应用。具体为：本发明发现在SVA不易感细胞系A549中过表达NCAM2基因后，SVA结构蛋白VP2显著增加，且SVA病毒拷贝数以及病毒滴度显著增加，表明NCAM2基因显著促进了SVA的复制，NCAM2过表达细胞系可作为SVA的生产细胞系，用于SVA或其疫苗的表达增效。

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种NCAM2为靶点在筛选抑制塞内卡病毒复制药物中的应用。具体为：本发明发现敲除NCAM2基因能够抑制塞内卡病毒的复制，可作为靶点用于筛选抑制塞内卡病毒复制的药物；以NCAM2基因为靶点设计了靶向NCAM2的sgRNA，结合CRISPR‑Cas9技术在HEK‑293T细胞中实现了NCAM2的敲除；HEK‑293T细胞中NCAM2基因敲除后，SVA的复制显著受到抑制，病毒核酸和蛋白滴度明显降低，对SVA的感染机制及防控策略提供一些理论依据，具有广阔的应用前景。