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本发明提供了肌醇单磷酸酶在制备肌醇的酶催化反应体系中的应用。本发明还提供了一种肌醇的制备方法，它是以淀粉为底物，加入葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、肌醇‑3‑磷酸合成酶、肌醇单磷酸酶作为酶催化剂，催化底物生成肌醇，所述的肌醇单磷酸酶来源于Archaeoglobus fulgidus，氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，或，肌醇单磷酸酶来源于Thermococcus kodakarensis，氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；或，肌醇单磷酸酶来源于Pseudothermotoga lettingae，氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。本发明筛选到性能良好的肌醇‑3‑磷酸合成酶和肌醇单磷酸酶，以全细胞投料的方式一锅法高效催化高浓度的淀粉转化为肌醇，无需使用NAD等辅酶。在60L反应体系下，催化200g/L的玉米淀粉，制备肌醇的单位产量达到161g/L，具有良好的工业应用前景。