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本发明公开了一种脱离自体血浆的高效脐血NK细胞扩增培养方案及其应用，本发明通过优化培养体系设计与工艺参数调控，经19天扩增培养后，可实现NK细胞扩增倍数达2000倍以上，细胞纯度提升至95%以上，对肿瘤细胞的杀伤效率高达80%以上，该方案成功攻克了传统技术中脐血NK细胞依赖自体血浆导致的扩增速率缓慢、细胞纯度不足、杀伤活性低下等核心痛点，同时规避了自体血浆因抗凝剂稀释引发的培养效果不稳定问题，显著提升了脐血NK细胞的制备效率与应用可靠性，具有极高的临床转化价值和广阔的产业化应用前景。