奥科（武汉）生物科技有限公司

本发明公开了一种高效低成本的固相合成寡核苷酸的方法，涉及寡核苷酸合成技术领域。本方法的步骤依次为合成固相载体合成柱，进行第一清洗；进行2次脱帽；第1次脱帽进行第一小压；第2次脱帽进行第二小压和1次第一大压；进行第二清洗；进行若干次活化偶联；除最后1次活化偶联以外的其他每次活化偶联都进行第三小压；最后1次活化偶联进行第四小压和1次第二大压；进行两次氧化；第一次氧化进行第五小压；第二次氧化进行第六小压和1次第三大压；进行两次盖帽；第一次盖帽进行第七小压；第二次氧化进行第八小压和1次第三大压；循环，氨解、干燥、洗脱，获得寡核苷酸。

本发明公开了一种基于大肠杆菌CRISPR‑Cas9的多轮基因编辑和清除质粒方法、系统，涉及CRISPR‑Cas9基因编辑技术领域。本发明将SacB毒素基因插入sgRNA表达质粒中，在Cas9表达质粒上引入由温度敏感型启动子控制的SacB基因表达盒。进行一轮基因编辑后，仅需在体系中加入适量蔗糖，即可利用SacB基因在蔗糖存在下产生的毒性，快速特异地清除携带SacB的sgRNA质粒，Cas9质粒因PL启动子在低温下抑制SacB表达而得以保留。当整个基因编辑完成后，升高培养温度并添加适量蔗糖，同时激活两个质粒上的SacB反筛系统，实现所有外源工具质粒的彻底清除。本发明实现了基因编辑工具质粒的高效、快速、序贯清除，显著提高了多轮基因编辑的效率，简化了操作流程。