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本发明涉及一种重组人III型胶原蛋白及其制备方法和应用，属于生物工程技术领域。本发明所述重组人III型胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，是通过五个特征性三股螺旋结构域的定向排列与多聚化扩展，结合毕赤酵母高密度发酵工艺，成功突破4.5g/L目标蛋白浓度的技术壁垒。本发明研究表明该重组蛋白在0.5%浓度下不仅保持80%以上细胞活力，更展现出显著协同效应‑促进成纤维细胞较空白对照组的迁移率提升超29%、角质形成细胞增殖率提高40.62%、黏附率提升6.53%，为开发兼具高效表达与多重生物活性的新型胶原蛋白产品提供了创新解决方案。