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本发明提供了一种用于异种移植的九基因编辑猪制备方法及其应用，属于基因工程技术领域。本发明在野生型猪的基础上，敲除GGTA1、B4GALNT2和CMAH基因，并在猪的ROSA26位点进一步敲入人CD55基因，获得F0代TKO/CD55四基因编辑猪。经过繁育筛选获得性状优良的F1代四基因编辑猪后，在其基础上进一步敲除猪B2M基因，敲入人CD59、TM、PROCR和EPO基因，最终获得九基因编辑克隆猪。本发明通过对猪的基因组进行修饰，提供了一种适用于猪到人异种移植的基因编辑供体猪。该供体猪特别适用于异种肾移植。本发明对促进异种器官移植研究和临床转化具有重要的应用价值。