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本发明涉及一种用于表征羰基还原酶底物适配性的动力学常数高通量快速测定方法，包括以下步骤：采用高通量方法测定粗酶液中目标羰基还原酶的蛋白浓度；使用粗酶液对底物库中的多种羰基化合物进行催化还原，高通量快速测定羰基还原酶的催化活性；根据测定的羰基还原酶催化不同浓度底物还原的活性以及测定的目标羰基还原酶的蛋白浓度，通过软件拟合、计算羰基还原酶的动力学参数V和K；根据羰基还原酶的动力学参数V以及相应羰基还原酶的摩尔浓度，计算拟一级动力学参数k，进而计算催化效率常数k/K。与现有技术相比，本发明可以快速、高通量地表征羰基还原酶对模式底物库中诸多底物的催化比活力以及动力学参数。