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本发明公开了一种基于数字PCR单管检测ESR1基因耐药突变位点的引物探针组合及其应用，属于分子检测技术领域，其中引物的序列如SEQ ID NO.1‑2所示，探针的序列如SEQ ID NO.3‑4所示，两个探针的5’端标记不同的荧光基团。本发明利用上述引物探针组合实现了单管同时对乳腺癌中常见的ESR1基因L536H、L536Q、L536R、L536P、Y537S、Y537C、Y537N、Y537D、D538G共9个耐药相关突变位点的高灵敏度且快速的检测，大大提高了ESR1基因检测效率，并降低了检测成本，以便指导乳腺癌的内分泌治疗。