基于CRISPR/Cas9基因功能解析的生物被膜增效型Bt制剂构建方法及其应用

本发明公开了一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建小菜蛾基因敲除品系的方法及其在苏云金芽胞杆菌生物被膜杀虫机制研究中的应用。所述方法首先通过生物测定确定四龄小菜蛾幼虫对Bt可湿性粉剂的敏感性阈值，随后采用浮游态和生物被膜态制剂处理幼虫，利用转录组测序分析中肠组织基因表达差异，筛选获得与肠胰蛋白酶和糜蛋白酶活性相关的关键靶基因。通过设计特异性sgRNA，采用显微注射技术将CRISPR/Cas9编辑系统导入小菜蛾胚胎，经多代筛选获得纯合敲除品系PlxyLOC105392280‑KO。通过比较突变体与野生型个体对Bt制剂的敏感性差异及中肠蛋白酶活性变化，证实该基因在调控小菜蛾对Bt生物被膜敏感性中的关键作用。本发明首次建立了小菜蛾肠胰蛋白酶和糜蛋白酶基因的精准编辑技术体系，阐明了其分子作用机制，为开发基于生物被膜技术的新型生物农药提供了重要技术支撑。